引用本文 ↓

许瑾,高妍,杨碧,等.基于珙桐SNP位点的dCAPS标记开发[J].生物资源, 2018, 40(4): 334-338.

Xu J, Gao Y, Yang B, et al. Exploration of SNP and relative dCAPS markers in Davidia involucrata [J]. Biotic Resources, 2018, 40(4): 334-338.

    摘要

    本研究收集了珙桐、喜树等19份植物材料,运用分子生物学和生物信息学手段比对分析了rpoBrpoCmatK等8个基因碱基序列上的单核苷酸多态性(SNP)位点,在atpF-atpH基因上找到了合适的SNP位点并设计了dCAPS引物,经PCR扩增和酶切验证后,将SNP转化为衍生型酶切扩增多态性序列(dCAPS)标记,可促进SNP标记在珙桐的遗传图谱构建、基因定位、种质资源鉴定、遗传多样性研究等领域的应用。

    Abstract

    Nineteen plant materials (Davidia inbolucrata, Camptotheca acuminate, etc.) were collected, and nucleotide sequences of eight gene such as rpoBrpoCmatK were analyzed by molecular biology and bioinformatics software to search for single nucleotide polymorphism (SNP). The derived cleaved amplified polymorphic sequence (dCAPS) primers were designed based on the SNPs and the genomic DNA was used for amplification. The amplicons were digested by restrict enzymes to convert SNPs into dCAPS markers which can be applied in genetic map construction, gene mapping, germplasm identification, genetic diversity research and other fields.

  • 0 引 言

    0

    衍生型酶切扩增多态性序列(derived cleaved amplified polymorphic sequence,dCAPS)是PCR反应和酶切相结合产生的一种分子标记方法[1,2]。它是在酶切扩增多态性序列(CAPS)标记基础上进一步改进而来的,CAPS技术的基本原理是先用已知位点的DNA序列去设计一套特异性的PCR引物,然后去扩增,接着用一种专一性的限制性内切酶酶切所得的扩增产物并进行限制性片段长度多态性(RFLP)分析;dCAPS技术则是通过在扩增引物中引入错配碱基,产生可以结合单核苷酸多态性(SNP) 位点引入新的限制性内切酶作用位点,经过核酸内切酶酶切,产生和CAPS 标记类似的多态性。dCAPS分子标记技术主要应用于植物基因的定位、图位克隆、分型和品种品系鉴定等方面的研究[3,4,5,6]

    珙桐(Davidia involucrata)属蓝果树科(Nyssaceae)珙桐属(Davidia),又名水梨子、鸽子树,为我国单属特有植物,是第三纪孑遗植物,有“活化石”之称。在1 000万年前新生代第三纪时期曾广泛分布于全世界,在第四纪冰川时期,大部分地区的珙桐相继灭绝,目前仅在我国西南地区海拔300~2 500 m 的山地林中存活[7]。珙桐同时被《国家珍贵树种名录》、《国家重点保护野生植物名录》和《中国稀有濒危保护植物名录》收录,是国家一级重点保护植物,具有很高的学术地位和科学研究价值[8]

    本研究通过对rpoBrpoCmatKatpF-atpHpskK-pskIndhJtrnLpsbA-trnH基因进行扩增,利用生物信息学的方法,筛选SNP位点,设计dCAPS引物,选择合适的内切酶,最终建立了快速鉴定珙桐的dCAPS分子标记体系。

  • 1 材料与方法

    1
  • 1.1 材料

    1.1
  • 1.1.1 植物材料

    1.1.1

    供试植物材料及其采集地点见表1

    表1 供试植物材料

    Table 1 Plant materials for testing

    序号材料名称学名采集地点(提供单位)
    1珙桐Davidia involucrata昆明植物园
    2珙桐Davidia involucrata昆明植物园
    3喜树Camptotheca acuminata昆明植物园
    4辣椒Capsicum annuum中国农业科学院作物科学研究所
    5菊花Dendranthema morifolium中国农业科学院作物科学研究所
    6水稻Oryza sativa中国农业科学院作物科学研究所
    7Pyrus spp.中国农业科学院作物科学研究所
    8水青树Tetracentron sinense昆明植物园
    9大豆Glycine max中国农业科学院作物科学研究所
    10攀枝花苏铁Cycas panzhihuaensis昆明植物园
    11福建柏Fokienia hodginsii昆明植物园
    12紫毛兜兰Paphiopedilum venustum昆明植物园
    13银带虾脊兰Calanthe argenteo-striata昆明植物园
    14鹅掌楸Liriodendron chinense昆明植物园
    15云南拟单性木兰Parakmeria yunnanensis昆明植物园
    16观光木Michelia odora昆明植物园
    17樱桃Cerasus pseudocerasus中国农业科学院作物科学研究所
    18马铃薯Solanum tuberosum中国农业科学院作物科学研究所
    19油菜Brassica napus中国农业科学院作物科学研究所
    表1
                    供试植物材料
  • 1.1.2 主要试剂

    1.1.2

    植物基因组DNA提取试剂盒来自天根生化科技有限公司,PCR扩增所用试剂和DNA Marker DL2000全部来自日本TaKaRa公司,引物合成是由北京奥科有限责任公司完成,PCR产物纯化所用ExoSAP-IT®酶来自美国GENE公司,其余测序相关试剂来自ABI公司,内切酶来自NEB公司,其他生化试剂全部为分析纯。

  • 1.2 方法

    1.2
  • 1.2.1 DNA提取

    1.2.1

    采集供试材料的新鲜叶片,于研钵中用液氮速冻,快速研磨。采用植物基因组DNA提取试剂盒提取植物材料的基因组DNA。

  • 1.2.2 PCR扩增

    1.2.2

    按照参考文献Renaud Lahaye[9]及生物条码协会(Consortium for the Barcode of Life, CBOL)公布的相关信息,选取rpoBrpoCmatKatpF-atpHpskK-pskIndhJtrnL[10]psbA-trnH[11]基因进行扩增。

  • 1.2.3 纯化与测序

    1.2.3

    PCR产物纯化采用ExoSAP-IT®酶来处理,可以去除多余的dNTP和引物。测序在ABI 3130测序仪上进行。

  • 1.2.4 数据分析及dCAPS引物设计

    1.2.4

    对测得珙桐序列通过NCBI blast获得亲缘关系近的物种序列,采用Sequence Analysis和DNASTAR软件进行校对和排序,通过多序列比较,寻找珙桐的SNP位点,利用网页版dCAPS Finder 2.0 (http://helix.wustl.edu/dcaps/)软件设计上游引物(5’-GGTTACATTTTTCATATGATCTCCG-3’),Primer Premier 5.0设计下游引物(5’-ATTTTATTGCCTTGGATG-3’),内切酶为AciI。

  • 1.2.5 PCR特异性扩增及酶切

    1.2.5

    PCR扩增选择25 μL体系,其中10×LA Buffer(不含Mg2+)2.5 μL,Mg2+(25 mmol/L)2.5 μL,dNTP(2.5 mmol/L)4 μL,上下游引物(10 mmol/L)各0.5 μL,LAtaq(5 U/μL)0.25 μL,基因组DNA取1 μL,ddH2O 13.75 μL。PCR扩增程序为:94 ℃预变性10 min,94℃变性30 s,51 ℃退火40 s,72 ℃延伸40 s,35个循环,72 ℃终延伸10 min。PCR扩增结束后,采用相应的限制性内切酶酶切,4%琼脂糖电泳分离,在紫外凝胶成像系统中观察,拍照。

  • 2 结 果

    2
  • 2.1 植物材料DNA提取和基因扩增

    2.1

    采用天根DNA提取试剂盒提取植物基因组DNA效果较好,可用于后续试验。PCR扩增产物纯化后用于测序。

  • 2.2 序列分析和dCAPS标记引物设计

    2.2

    用Sequence Analysis和DNAStar软件对rpoBrpoCmatKatpF-atpHpskK-pskIndhJtrnLpsbA-trnH基因的数据进行比对、编辑,在atpF-atpH基因中找到了可用于dCAPS引物设计的1个A→C的SNP位点(图1)。

    图1
                            珙桐atpF-atpH 基因SNP位点

    图1 珙桐atpF-atpH 基因SNP位点

    Fig.1 SNP site of atpF-atpH gene in Davidia involucrata

  • 2.3 dCAPS引物扩增结果

    2.3

    图2可以看出,仅有珙桐和喜树材料有扩增,特异性条带大小约为400 bp左右,而其他植物材料均未有扩增。

    图2
                            dCAPS标记扩增结果

    图2 dCAPS标记扩增结果

    Fig.2 Result of dCAPS amplification

    M:DL2000; 1.珙桐(1); 2.珙桐(2); 3.喜树; 4.辣椒; 5.菊花; 6.水稻; 7.鸭梨; 8.水青树; 9.大豆; 10.攀枝花苏铁; 11.福建柏; 12.紫毛兜兰; 13.银脉虾脊兰; 14.鹅掌楸; 15.云南拟单性木兰; 16.观光木; 17.樱桃; 18.马铃薯; 19.油菜; CK:水对照

    M:DL2000; 1.Davidia involucrata(1); 2.Davidia involucrata(2); 3.Camptotheca acuminata; 4.Capsicum annuum; 5.Dendranthema morifolium; 6.Oryza sativa; 7.Pyrus spp.; 8.Tetracentron sinense; 9.Glycine max; 10.Cycas panzhihuaensis; 11.Fokienia hodginsii; 12.Paphiopedilum venustum; 13.Calanthe argenteo-striata; 14.Liriodendron chinense; 15.Parakmeria yunnanensis; 16.Michelia odora; 17.Cerasus pseudocerasu; 18.Solanum tuberosum; 19.Brassica napus; CK: water control

  • 2.4 酶切结果

    2.4

    图3可以看出,经AciI酶切后,两种珙桐材料的酶切片段大小均为280 bp左右,而喜树材料并未被酶切,因而通过此方法可以达到鉴定珙桐的目的。

    图3
                            dCAPS标记酶切结果

    图3 dCAPS标记酶切结果

    Fig.3 Result of dCAPS restriction enzyme digestion

    1. 喜树; 2. 珙桐(1); 3. 珙桐(2); M: DL2000

    1. Camptotheca acuminata; 2. Davidia involucrata(1); 3. Davidia involucrata(2); M: DL2000

  • 3 讨 论

    3

    我国是世界上生物多样性最丰富的地区之一,而我国大量的物种及其遗传资源也在遭到国内、外人为的威胁[12,13]。一些重要物种,如名贵兰花品种,由于巨大的商业利益驱使人们对其乱挖滥采,并使其流入国外,导致原生地资源枯竭或丧失,严重影响了生物多样性。与此同时,物种资源的保护和鉴定工作还处于起步阶段[14]。SNP的检测方法有很多种,一般来说分为两大类,一类是以凝胶电泳为基础的传统经典的检测方法,如RFLP、简单重复序列标记(SSR)、扩增片段长度多态性(AFLP)等;另一类是高通量,自动化程度较高的检测方法,如DNA测序、质谱、DNA芯片检测等[15,16]。最直接的方法还是从已定位的序列标签位点(STS)和表达序列标签(EST)挖掘出SNP位点。以上方法各有优缺点,如质谱法具有通量高、灵敏度高等优点,但有一些SNP不适合设计引物,且成本较高;RFLP法可利用探针有很多,但工作量比较大,重复度不高。

    DNA条形码(DNA barcode)是指生物体内能够代表该物种的、标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段[17]。它已经成为生态学研究的重要工具,不仅用于物种鉴定,同时也有助于生物学家进一步了解生态系统内发生的相互作用。本研究通过扩增rpoBrpoCmatKatpF-atpHpskK-pskIndhJtrnLpsbA-trnH条码基因并测序分析来发掘SNP位点。研究表明通过条码基因挖掘SNP位点相比于传统方法(EST数据库)来说,实验周期较短,成本也相对较低,同时还能保证较好的重复性和稳定性[18]

    本文针对珙桐dCAPS分子标记的成功开发,可促进SNP标记在珙桐的遗传图谱构建、基因定位、种质资源鉴定、遗传多样性研究等领域的应用,也为今后物种资源检验检疫工作提供了方法借鉴,有助于我国物种资源的可持续利用。

    • 1

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许瑾

工作单位:1中国检验检疫科学研究院,北京 100029

高妍

工作单位:1中国检验检疫科学研究院,北京 100029

杨碧

工作单位:2昆明海关,云南 昆明 650228

宋云

工作单位:1中国检验检疫科学研究院,北京 100029

李明福

工作单位:1中国检验检疫科学研究院,北京 100029

陈乃中

工作单位:1中国检验检疫科学研究院,北京 100029

序号材料名称学名采集地点(提供单位)
1珙桐Davidia involucrata昆明植物园
2珙桐Davidia involucrata昆明植物园
3喜树Camptotheca acuminata昆明植物园
4辣椒Capsicum annuum中国农业科学院作物科学研究所
5菊花Dendranthema morifolium中国农业科学院作物科学研究所
6水稻Oryza sativa中国农业科学院作物科学研究所
7Pyrus spp.中国农业科学院作物科学研究所
8水青树Tetracentron sinense昆明植物园
9大豆Glycine max中国农业科学院作物科学研究所
10攀枝花苏铁Cycas panzhihuaensis昆明植物园
11福建柏Fokienia hodginsii昆明植物园
12紫毛兜兰Paphiopedilum venustum昆明植物园
13银带虾脊兰Calanthe argenteo-striata昆明植物园
14鹅掌楸Liriodendron chinense昆明植物园
15云南拟单性木兰Parakmeria yunnanensis昆明植物园
16观光木Michelia odora昆明植物园
17樱桃Cerasus pseudocerasus中国农业科学院作物科学研究所
18马铃薯Solanum tuberosum中国农业科学院作物科学研究所
19油菜Brassica napus中国农业科学院作物科学研究所
/html/swzy/201804006/alternativeImage/17d66f32-5ed3-4c00-91ef-6abc11105031-F001.jpg
/html/swzy/201804006/alternativeImage/17d66f32-5ed3-4c00-91ef-6abc11105031-F002.jpg
/html/swzy/201804006/alternativeImage/17d66f32-5ed3-4c00-91ef-6abc11105031-F003.jpg

表1 供试植物材料

Table 1 Plant materials for testing

图1 珙桐atpF-atpH 基因SNP位点

Fig.1 SNP site of atpF-atpH gene in Davidia involucrata

图2 dCAPS标记扩增结果

Fig.2 Result of dCAPS amplification

图3 dCAPS标记酶切结果

Fig.3 Result of dCAPS restriction enzyme digestion

image /

无注解

无注解

M:DL2000; 1.珙桐(1); 2.珙桐(2); 3.喜树; 4.辣椒; 5.菊花; 6.水稻; 7.鸭梨; 8.水青树; 9.大豆; 10.攀枝花苏铁; 11.福建柏; 12.紫毛兜兰; 13.银脉虾脊兰; 14.鹅掌楸; 15.云南拟单性木兰; 16.观光木; 17.樱桃; 18.马铃薯; 19.油菜; CK:水对照

M:DL2000; 1.Davidia involucrata(1); 2.Davidia involucrata(2); 3.Camptotheca acuminata; 4.Capsicum annuum; 5.Dendranthema morifolium; 6.Oryza sativa; 7.Pyrus spp.; 8.Tetracentron sinense; 9.Glycine max; 10.Cycas panzhihuaensis; 11.Fokienia hodginsii; 12.Paphiopedilum venustum; 13.Calanthe argenteo-striata; 14.Liriodendron chinense; 15.Parakmeria yunnanensis; 16.Michelia odora; 17.Cerasus pseudocerasu; 18.Solanum tuberosum; 19.Brassica napus; CK: water control

1. 喜树; 2. 珙桐(1); 3. 珙桐(2); M: DL2000

1. Camptotheca acuminata; 2. Davidia involucrata(1); 3. Davidia involucrata(2); M: DL2000

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