引用本文 ↓

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Cai L T, Lu N, Shen Z X, et al. Exploration of phage resources of Ralstonia Solanacearum causing tobacco bacterial wilt [J]. Biotic Resources, 2018, 40(4): 339-344.

    摘要

    由青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的烟草青枯病是烟草种植过程中一种重要的细菌性病害。为了开展利用噬菌体防控烟草青枯病的研究,本研究以烟田产区的7株烟草青枯菌为宿主,从烟田土壤中分离到了14个对烟草青枯菌具有侵染性的烈性噬菌体,说明烟田土壤中普遍存在烟草青枯菌噬菌体。选取噬菌体ϕPB2和ϕPB34,电镜观察确定其具有十二面体的头部和粗短的尾部,属于肌尾噬菌体科。噬菌体的宿主谱分析显示,筛选到的噬菌体对分别从烟草、西红柿和花生分离的青枯菌株系的侵染性有所差异。本研究分离发掘的14个对烟草青枯菌侵染的噬菌体,为利用噬菌体防控烟草青枯病的生防策略研究提供了噬菌体资源。

    Abstract

    Tobacco bacterial wilt caused by Ralstonia solanacearum is an important bacterial disease in flue-cured tobacco plantation. In order to provide phage resources infecting Ralstonia solanacearum for bio-control research of tobacco bacterial wilt,in this study, 14 lytic phages infecting Ralstonia solanacearum were isolated and purified from soil of tobacco-planting field. It shows that phages infecting Ralstonia solanacearum are widespread in soils of tobacco-planting field. Observation of ϕPB2 and ϕPB34 under electron microscope showed that they had isometric heads and short tails, belonging to Podoviridae. Host range detection analysis of the phages showed that the isolated phage resources were different in infection against Ralstonia solanacearum strains isolated from tobacco,peanut and potato respectively. The 14 phages infecting Ralstonia solanacearum isolated in this study provide phage resources for the bio-control of tobacco bacterial wilt.

  • 0 引 言

    0

    青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum,简称青枯菌)引起的烟草青枯病是烟叶生产过程中的主要的病害之一,俗称“半边疯”。最明显的症状是枯萎,发病严重时会造成整株死亡,造成严重的经济损失。目前,已有的防控烟草青枯病的手段和措施包括种植抗性品种[1,2]、化学防控[3]、合理轮作[4]、拮抗菌剂[5,6]、合理的栽培措施等[7]。在烟叶生产中,这些方法并不总是能有效地控制烟草青枯病的发生,而且化学农药和抗生素的使用会导致环境污染,也会导致抗生素耐药菌的产生。随着人们对环境安全和农产品安全要求的提高,以及人们对耐药性或抗药性菌群出现的担忧,青枯菌病原菌的防控迫切需要一种有效和安全的方法和策略。

    噬菌体在自然环境中非常丰富,只要有细菌存在的地方就可能有噬菌体的身影。尤其是作为微生物大本营的土壤,其中必然蕴藏着丰富的噬菌体资源[8]。由于噬菌体能有效地感染对其敏感的宿主[9],而且是专一感染对其敏感的宿主,对其他菌群不会有破坏作用,因此噬菌体疗法作为传统药物疗法的替代备选方案被寄予厚望[10,11]。利用噬菌体来感染和杀死细菌的生物防治理念已经有很长的历史[12,13],近年来噬菌体疗法代替抗生素来防控细菌性病害已被用于水产养殖[14,15]、农业细菌性病害防控[16],甚至用于食品[17]和人类健康[18,19]

    烟草青枯病的发生会对烟叶生产造成严重的经济损失,然而关于使用噬菌体控制农业烟草青枯菌的报道仍然较少,仅有几个可以感染烟草青枯菌的噬菌体被分离鉴定和利用研究[20,21,22,23]。因此研究和开发烟草青枯病的生物防控策略和手段十分重要。本研究从烟田土壤中分离得到了对烟草青枯菌具有侵染裂解性的噬菌体株系,旨在为开展利用噬菌体防控烟草青枯病、控制烟草青枯菌群体的研究提供噬菌体资源。

  • 1 材料与方法

    1
  • 1.1 菌株及土壤样品

    1.1

    青枯菌株系来源和宿主信息参见表1,其中从烤烟病株分离的青枯菌R. solanacearum ZP和R. solanacearum FXC用于噬菌体的筛选纯化,分离自花生、西红柿、烤烟和马铃薯的其他青枯菌用于噬菌体宿主谱的检测。

    表1 青枯菌的来源与宿主信息

    Table 1 Origin and host information of the Ralstonia solanacearum strains

    菌种名称分离源(宿主)提供单位
    青枯雷尔氏菌ZP烤烟贵州省烟草科学研究院
    青枯雷尔氏菌A烤烟贵州省烟草科学研究院
    青枯雷尔氏菌FXC烤烟贵州省烟草科学研究院
    青枯雷尔氏菌TZ烤烟贵州省烟草科学研究院
    青枯雷尔氏菌1.70花生广东省微生物资源中心
    青枯雷尔氏菌1.71西红柿广东省微生物资源中心
    青枯雷尔氏菌1.74马铃薯广东省微生物资源中心
    表1
                    青枯菌的来源与宿主信息

    CPG培养基(10 g/L 蛋白胨,5 g/L 蔗糖,1 g/L 水解酪蛋白;固体培养基加1.6%的琼脂)参考Fujiwara等[24]方法配制。0.22 μm的过滤滤膜购自波尔公司(PALL corporation)。

    土壤样品取自贵州省遵义市、威宁县、福泉市、麻江县、兴仁县、兴义县有青枯病发生的烟田。

  • 1.2 青枯菌的培养

    1.2

    采用CPG液体培养基培养青枯菌,28 ℃下转速为120 r/min条件下震荡过夜,再转接至新的CPG液体培养基培养中,120 r/min震荡培养4~6 h,OD600 nm值为0.1~0.3时,备噬菌体筛选及噬菌体宿主谱的检测用。

  • 1.3 土壤样品处理

    1.3

    在1.0 g土样中加入5 mL的SM缓冲液(配方:5.8 g氯化钠,2.0 g七水硫酸镁,Tris-HCl(1 mol/L, pH 7.5)缓冲液,0.002%(m/V)的明胶),0.22 μm孔径的滤器过滤,滤液暂存于4 ℃冰箱,备噬菌体筛选用。

  • 1.4 噬菌体的分离纯化

    1.4

    采用共培养的方法筛选和纯化噬菌体,取上述备用的土壤滤液20 μL与青枯菌液100 μL混合均匀后,涂布于CPG固体培养基上,在28 ℃下共同培养16~20 h,观察噬菌斑,用灭过菌的10 μL的枪头垂直接触候选目标噬菌斑,然后放入400 μL的无菌水中,室温或4 ℃冰箱中短暂保存。噬菌体液中加入终浓度含20%的甘油,在-20 ℃冰箱中长期保存。

  • 1.5 噬菌体的电镜观察

    1.5

    取20 μL分离纯化的噬菌体悬液(0.1 mol/L乙酸铵缓冲液,1×109 PFU/mL)滴于铜网上,静置片刻,除去液体,用2.0%的磷戊酸钾(pH 6.8)负染20 s,在透射电子显微镜(200 kV)下观察噬菌体形态。

  • 1.6 噬菌体宿主谱检测

    1.6

    噬菌体宿主谱检测采用双层平板培养法,取筛选纯化好的噬菌体液20 μL与青枯菌液150 μL混合均匀后,然后与事先灭菌好的3 mL低熔点琼脂液 0.7%(m/V)混匀,均匀涂布于预先准备好的CPG固体培养基上,在28 ℃培养箱中培养20~36 h,观察噬菌斑。

  • 2 结果分析

    2
  • 2.1 烟草青枯菌噬菌体的分离纯化

    2.1

    分别以青枯雷尔氏菌ZP和青枯雷尔氏菌FXC为宿主,对获取的土壤样品的过滤液进行检测,按照噬菌体斑的大小、形态、透明度以及噬菌体对不同青枯菌株系侵染差异的情况,共分离纯化到14个对青枯菌能形成透明噬菌斑的噬菌体资源(表2),从贵州省部分烟区土壤样品中筛选、纯化和保存的青枯菌噬菌体株系来看,大部分有烟草青枯病的区域中,土壤样品中能筛选到青枯菌噬菌体(部分没有筛选道噬菌体的土壤样品信息未列出)。其中来自贵州省不同烟区的噬菌体ϕPB2和ϕPB34,它们对实验中所用的大多数青枯菌株系都能形成所形成透明、清亮的噬菌体斑,而且噬菌体斑的边缘清晰。图1显示的是以青枯菌R. solanacearum ZP为宿主,ϕPB2和ϕPB34 所形成的透明、清亮噬菌斑。后续电镜观察实验选取噬菌体ϕPB2和ϕPB34为代表。

    表2 用青枯菌R. solanacearum ZP, R. solanacearum A和R. solanacearum FXC为宿主从部分烟区土样中筛选的青枯菌噬菌体

    Table 2 Phage resources isolated and purified from soils of tobacco-planting field used R. solanacearum ZP, R. solanacearum A and R. solanacearum FXC as hosts

    噬菌体编号土壤样品来源
    ϕPB 2贵州省福泉市烟草研究院基地西场
    ϕPB 8贵州省遵义乐山烟草科技园
    ϕPB 9贵州省遵义乐山烟草科技园
    ϕPB 10贵州省黔兴仁县雨樟镇
    ϕPB 11安徽省宣城市烟区
    ϕPB 12贵州省福泉市烟草研究院基地东场
    ϕPB 4贵州省毕节市威宁县黑石镇
    ϕPB 5贵州省毕节市威宁县黑石镇
    ϕPB 15贵州省麻江县龙山镇大塘村
    ϕPB 16贵州省麻江县龙山镇大塘村
    ϕPB 23贵州省兴义县鲁囤镇七一村
    ϕPB 33贵州省黔西南兴仁县雨樟镇
    ϕPB 34贵州省黔西南兴仁县巴铃村
    ϕPB 35贵州省兴义市白碗窑村
    表2
                    用青枯菌R. solanacearum ZP, R. solanacearum A和R. solanacearum FXC为宿主从部分烟区土样中筛选的青枯菌噬菌体
    图1
                            以青枯菌R. solanacearum ZP为宿主,ϕPB2和ϕPB34所形成的噬菌斑形态

    图1 以青枯菌R. solanacearum ZP为宿主,ϕPB2和ϕPB34所形成的噬菌斑形态

    Fig.1 Plaques of ϕPB2 and ϕPB34 in R. solanacearum ZP host

    A:对照;B:ϕPB2形成的噬菌斑;C:ϕPB34形成的噬菌斑

    A:control; B:ϕPB2 in R. solanacearum ZP; C:ϕPB34 in R. solanacearum ZP

  • 2.2 噬菌体ϕPB2和ϕPB34的形态观察

    2.2

    透射电镜(200 kV)观察显示,噬菌体ϕPB2和ϕPB34头部外形呈十二体,尾部粗短,带有尾鞘(图2),属于有尾噬菌体属(Caudovirales),短尾噬菌体科(Podoviridae)。

    /html/swzy/201804007/alternativeImage/5ac1d5d1-905b-48e0-8b28-0d6eb090ebb8-F002.jpg
    /html/swzy/201804007/alternativeImage/5ac1d5d1-905b-48e0-8b28-0d6eb090ebb8-F003.jpg

    图2 噬菌体ϕPB2和ϕPB34的形态结构(左:ϕPB2,右:ϕPB34)

    Fig.2 Electron micrograph of ϕPB2 and ϕPB34 (left:ϕPB2, right:ϕPB34)

  • 2.3 噬菌体宿主谱分析

    2.3

    表3可以看出,筛选到的噬菌体资源,侵染裂解青枯菌的系谱有所差异,实验用所有的噬菌体资源对青枯菌R. solanacearum FXC株系均具有侵染和裂解能力;噬菌体ϕPB34和ϕPB35对实验用的所有青枯菌株系都具有侵染和裂解特性;除青枯菌R. solanacearum 1.71外,噬菌体ϕPB2对实验用的所有青枯菌株系都具有侵染和裂解特性;噬菌体ϕPB16不能侵染裂解实验中用的青枯菌株系R. solanacearum ZP, R. solanacearum TZ和R. solanacearum 1.71;噬菌体ϕPB23只侵染实验中用的青枯菌株系R. solanacearum 1.74和R. solanacearum FXC。为了以后开展利用噬菌体资源防控烟草青枯病的研究,选取来从贵州省福泉市烟草病圃中分离的青枯菌R. solanacearum FXC作为宿主,利用噬菌体ϕPB2和ϕPB34分别抑制青枯菌R. solanacearum FXC在液体培养基中生长,结果显示在液体培养基中,接种有噬菌体ϕPB2和ϕPB34的处理中(图3,B、C),培养基比对照处理(图3,A)明显清亮,说明在液体培养基中,噬菌体ϕPB2和ϕPB34都能有效地抑制青枯菌R. solanacearum FXC的生长(图3)。

    表3 噬菌体侵染青枯菌株系的检测

    Table 3 Detection of phage and host interaction

    噬菌体青枯菌(R. solanacearum)
    AZPTZ1.701.711.74FXC
    ϕPB2++++-++
    ϕPB8+++++++
    ϕPB9+++++++
    ϕPB10+++++++
    ϕPB11+++++++
    ϕPB12+--++++
    ϕPB4+--+-++
    ϕPB5+--+-++
    ϕPB15+++++++
    ϕPB16+--+-++
    ϕPB23-----++
    ϕPB33++++-++
    ϕPB34+++++++
    ϕPB35+++++++
    表3
                    噬菌体侵染青枯菌株系的检测

    表中“+”表示能形成透明的噬菌斑;“-”表示未出现透明的噬菌斑

    "+" means formation of transparent plaques; "-" means no formation of transparent plaque

    图3
                            液体培养基中噬菌体ϕPB2和ϕPB34抑制青枯菌的生长

    图3 液体培养基中噬菌体ϕPB2和ϕPB34抑制青枯菌的生长

    Fig.3 Inhibition of the growth of R. solanacearum FXC in the liquid media by ϕPB2 and ϕPB34

    A:ϕPB2; B:ϕPB34; C:对照

    A:ϕPB2; B:ϕPB34; C:Control

  • 3 讨 论

    3

    噬菌体是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒的总称,寄生并侵害细菌的一类噬菌体,又称细菌病毒。噬菌体种类繁多,形态丰富,细菌病毒的分类一直得到研究者的关注,其分类体系一直在被不断完善和补充,从1976年国际病毒分类委员会发表“病毒的分类与命名”第二次报告中将细菌病毒分为8个科,到2011年“病毒的分类与命名”第九次报告将细菌病毒分为87个科[25,26],2017年国际病毒分类委员会再次对细菌性病毒分类体系进行征集[27,28,29]。近年来,报道的能侵染来自西红柿青枯菌的噬菌体具有多态性,包括有肌尾噬菌体科的ϕRSA1和ϕRSL1 [30,31]、丝状噬菌体科的ϕRSS1[32]、短尾噬菌体科的ϕRSB1 [33],它们的遗传物质有的是双链DNA,如ϕRSA1[30],有的是单链DNA,如ϕRSS1[32]。我们从植烟土壤中筛选的噬菌体ϕPB2和ϕPB34,从形态角度分析属于尾噬菌体属的短尾噬菌体科,不过其遗传物质有待于进一步分析。另外,温度检测结果显示噬菌体ϕPB2在4~45 ℃温度范围内稳定,但温度高于55 ℃和65 ℃时,没有检测到噬菌体对青枯菌的裂解活性[21],与Bae等[34]报到的噬菌体 PE204 在温度15~60 ℃ 范围内稳定有区别。

    在烟叶生产过程中,采用合适的轮作制度、利用农药和抗生素进行防控,在一定程度上能减少烟草青枯菌病导致的损失,但并不总是有效的,而且农药和抗生素会引起人们对环境污染和抗生素耐药菌的忧虑。自从噬菌体被发现后[12],利用这类细菌病毒防控农作物细菌性病害就已经得到了关注[35,36]。Fujiwara等[24]报道了利用青枯菌烈性噬菌体ϕRSA1, ϕRSB1和 ϕRSL1防控西红柿青枯病的研究,并建议采用噬菌体ϕRSL1对青枯病进行生物防治。在烟草青枯病防控方面,Tanaka等[37]研究报道利用噬菌体防控烟草青枯病能有效降低烟草青枯病的发病率。但是迄今为止,对烟田土壤中烟草青枯菌噬菌体的多样性及其资源的挖掘研究仍然十分缺乏。本研究烟田土壤中分离纯化到14个烟草青枯菌噬菌体,说明烟田土壤中有丰富的青枯菌噬菌体资源。本研究噬菌体宿主谱实验表明ϕPB2、 ϕPB8、ϕPB33、ϕPB34和ϕPB35,对来自烤烟的青枯菌都具有侵染和裂解特性,在烟草青枯病防控的生防策略研究中具有较大潜力。本研究筛选到的噬菌体资源的青枯菌宿主谱有所差异,结果暗示,筛选出专一性、裂解性能强的噬菌体资源,对于利用噬菌体防控烟草青枯病的研究是一个重要的环节。本研究为利用烟草青枯菌噬菌体开发防控烟草青枯病的生防策略研究提供了噬菌体资源。

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蔡刘体

工作单位:1贵州省烟草科学研究院,贵州 贵阳 550081

陆宁

工作单位:1贵州省烟草科学研究院,贵州 贵阳 550081

沈子霞

工作单位:2贵州省烟草公司遵义县公司,贵州 遵义 563003

汪汉成

工作单位:1贵州省烟草科学研究院,贵州 贵阳 550081

菌种名称分离源(宿主)提供单位
青枯雷尔氏菌ZP烤烟贵州省烟草科学研究院
青枯雷尔氏菌A烤烟贵州省烟草科学研究院
青枯雷尔氏菌FXC烤烟贵州省烟草科学研究院
青枯雷尔氏菌TZ烤烟贵州省烟草科学研究院
青枯雷尔氏菌1.70花生广东省微生物资源中心
青枯雷尔氏菌1.71西红柿广东省微生物资源中心
青枯雷尔氏菌1.74马铃薯广东省微生物资源中心
噬菌体编号土壤样品来源
ϕPB 2贵州省福泉市烟草研究院基地西场
ϕPB 8贵州省遵义乐山烟草科技园
ϕPB 9贵州省遵义乐山烟草科技园
ϕPB 10贵州省黔兴仁县雨樟镇
ϕPB 11安徽省宣城市烟区
ϕPB 12贵州省福泉市烟草研究院基地东场
ϕPB 4贵州省毕节市威宁县黑石镇
ϕPB 5贵州省毕节市威宁县黑石镇
ϕPB 15贵州省麻江县龙山镇大塘村
ϕPB 16贵州省麻江县龙山镇大塘村
ϕPB 23贵州省兴义县鲁囤镇七一村
ϕPB 33贵州省黔西南兴仁县雨樟镇
ϕPB 34贵州省黔西南兴仁县巴铃村
ϕPB 35贵州省兴义市白碗窑村
/html/swzy/201804007/media/5ac1d5d1-905b-48e0-8b28-0d6eb090ebb8-image001.png
/html/swzy/201804007/alternativeImage/5ac1d5d1-905b-48e0-8b28-0d6eb090ebb8-F002.jpg
/html/swzy/201804007/alternativeImage/5ac1d5d1-905b-48e0-8b28-0d6eb090ebb8-F003.jpg
噬菌体青枯菌(R. solanacearum)
AZPTZ1.701.711.74FXC
ϕPB2++++-++
ϕPB8+++++++
ϕPB9+++++++
ϕPB10+++++++
ϕPB11+++++++
ϕPB12+--++++
ϕPB4+--+-++
ϕPB5+--+-++
ϕPB15+++++++
ϕPB16+--+-++
ϕPB23-----++
ϕPB33++++-++
ϕPB34+++++++
ϕPB35+++++++
/html/swzy/201804007/alternativeImage/5ac1d5d1-905b-48e0-8b28-0d6eb090ebb8-F004.jpg

表1 青枯菌的来源与宿主信息

Table 1 Origin and host information of the Ralstonia solanacearum strains

表2 用青枯菌R. solanacearum ZP, R. solanacearum A和R. solanacearum FXC为宿主从部分烟区土样中筛选的青枯菌噬菌体

Table 2 Phage resources isolated and purified from soils of tobacco-planting field used R. solanacearum ZP, R. solanacearum A and R. solanacearum FXC as hosts

图1 以青枯菌R. solanacearum ZP为宿主,ϕPB2和ϕPB34所形成的噬菌斑形态

Fig.1 Plaques of ϕPB2 and ϕPB34 in R. solanacearum ZP host

图2 噬菌体ϕPB2和ϕPB34的形态结构(左:ϕPB2,右:ϕPB34)

Fig.2 Electron micrograph of ϕPB2 and ϕPB34 (left:ϕPB2, right:ϕPB34)

图2 噬菌体ϕPB2和ϕPB34的形态结构(左:ϕPB2,右:ϕPB34)

Fig.2 Electron micrograph of ϕPB2 and ϕPB34 (left:ϕPB2, right:ϕPB34)

表3 噬菌体侵染青枯菌株系的检测

Table 3 Detection of phage and host interaction

图3 液体培养基中噬菌体ϕPB2和ϕPB34抑制青枯菌的生长

Fig.3 Inhibition of the growth of R. solanacearum FXC in the liquid media by ϕPB2 and ϕPB34

image /

无注解

无注解

A:对照;B:ϕPB2形成的噬菌斑;C:ϕPB34形成的噬菌斑

A:control; B:ϕPB2 in R. solanacearum ZP; C:ϕPB34 in R. solanacearum ZP

无注解

无注解

表中“+”表示能形成透明的噬菌斑;“-”表示未出现透明的噬菌斑

"+" means formation of transparent plaques; "-" means no formation of transparent plaque

A:ϕPB2; B:ϕPB34; C:对照

A:ϕPB2; B:ϕPB34; C:Control

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