引用本文 ↓

石晓玲,林胜红,刘震飞,等.高产木质素酶荧光假单胞杆菌L-520的筛选及其发酵工艺优化[J].生物资源, 2018, 40(4): 353-360.

Shi X L, Lin S H, Liu Z F, et al. Screening of Pseudomonas fluorescens L-520 with high ligninase activity and optimization of its fermentation process [J]. Biotic Resources, 2018, 40(4): 353-360.

    摘要

    利用苯胺蓝鉴别培养基及产酶培养基进行菌种筛选,从甘肃兴隆山分离得到的10株菌株中筛选到一株高产木质素酶活力的菌株L-520,对该菌株进行16S rDNA鉴定,确定该菌为荧光假单胞杆菌(Pseudomonas fluorescens)。分别考察了接种量、装液量,初始pH对L-520发酵产酶的影响,以及碳源、氮源对木质素酶活力的影响。结果得到最佳培养基为:蔗糖 1%,NH4Cl 0.2%, KH2PO4 0.1%,MgSO4·7H2O 0.05%。优化后的发酵条件为:初始pH 5,接种量3%,装液量50%。经发酵工艺优化后,漆酶(Lac)、木质素过氧化物酶(LiP)、锰过氧化物酶(MnP)三种酶活分别为16.43 U/L, 106.32 U/L, 95.89 U/L,与初始酶活相比分别提高了8.7、14.74、11.09倍。本研究筛选得到的荧光假单胞杆菌有助于染料废水中偶氮染料的降解。

    Abstract

    A strain L-520 of high yield lignin enzyme activity was screened from 10 strains isolated from the Xinlong mountain in Gansu by aniline blue differential medium. The strain was identified as Pseudomonas fluorescens by 16S rDNA sequence analysis. The influencing factors of enzyme production fermentation of L-520, such as inoculum volume, liquid volume, initial pH were studied, and the carbon source and nitrogen source effects on the activity of lignin enzyme were also investigated. The results showed that, the optimum fermentation medium was: sucrose 1%, NH4Cl 0.2%, KH2PO4 0.1%,MgSO4·7H2O 0.05%; the optimum cultivation conditions were initial pH 5, inoculum amount 3%, liquid volume 50%. After optimization of the fermentation process, the activities of laccase(Lac), lignin peroxidase(LiP) and manganese-dependent peroxidase(MnP) were 16.43 U/L, 106.32 U/L and 95.89 U/L, respectively, which were increased 8.7, 14.74 and 11.09 times, respectively, compared with the initial enzyme activity. Pseudomonas fluorescens L-520, the high-yielding ligninase strain obtained in this study could be of great importance for the degradation of azo dyes in dye wastewater.

  • 0 引 言

    0

    印染工业每年产生大约上万种 7×105 t的染料和有色废液,其中10%被排放到污水中[1]。在纺织业、印刷业、皮革业以及化妆品业,含氮染料是最主要的污染成分[2]。印染废水中含有生物毒性的有机物,即使浓度很低,也会造成水体透光率降低,导致水生动植物逐渐灭绝。因此,印染废水的处理已成为环境领域的难点之一。对于染料污水的处理,一般运用化学、物理的处理方法,但这些处理的技术设备昂贵以及会产生二次污染物,因此不被人们认可。

    近年来,微生物降解技术因其反应条件温和、高效、经济、不产生二次污染物被人们关注。白腐菌(white-rot fungi)能通过自身所分泌的特殊降解酶系及其它机制将各种人工合成染料彻底降解为 CO2 和 H2O,木质素降解酶系在染料污水处理过程中起到重要作用,成为近几年治理染料废水的新型的有效处理方法[3,4]。白腐菌对染料的脱色主要依靠白腐菌自身分泌的胞外酶与染料分子反应进行染料的催化脱色[5]。目前,被认为最为重要并研究得较多的降解木质素酶有 3 种,即漆酶(laccase, Lac)、木质素过氧化物酶(lignin peroxidase, LiP)和锰过氧化物酶(manganese-dependent peroxidase, MnP)[6]。据文献报道,假单胞菌属能够产生偶氮还原酶对偶氮染料进行脱色,细菌在厌氧条件下先将偶氮染料的发色基团(N=N)打开,降解为无色的芳香胺,再在有氧或无氧条件下将其进一步降解为其他无害小分子产物[7]。Osma[8]等人在研究漆酶降解染料的过程中发现漆酶能够催化使染料的发色基团断裂,降解为两个无色的小分子产物。李平[9]等人对显革菌属的Phanerochaete sp.HSD产锰过氧化物酶培养基进行优化,在该培养基中Phanerochaete sp.HSD锰过氧化物酶活性提高到(2 613±22) U/L;同时利用该菌株对偶氮染料进行吸附,紫外可见分光分析表明MnP对偶氮染料脱色原因均是因为染料被酶解,特别是偶氮双键被打开所致。

    综上所述,木质素酶系对于染料废水的处理有着重要的影响,被优化后的菌株酶活提高并且更具脱色与降解能力。本研究通过筛选得到一株可降解偶氮染料的荧光假单胞杆菌(Pseudomonas fluorescens),并对菌株发酵产酶的培养基与发酵条件进行了优化,显著提高了木质素酶的活力,为假单胞属在偶氮染料的脱色与降解应用奠定了基础。

  • 1 材料与方法

    1
  • 1.1 实验材料

    1.1

    菌种来源于甘肃兴隆山土壤样品,由实验室分离并保存。

  • 1.2 培养基

    1.2

    PDA培养基:马铃薯200 g/L,C6H12O6 20 g/L,琼脂 20 g/L,蒸馏水 1 L,pH值自然。

    苯胺蓝培养基:C6H12O6 20 g/L,蛋白胨 20 g/L,琼脂 20 g/L,水溶性苯胺蓝0.1 g/L,蒸馏水1 L,pH值自然[10]

    LB培养基:蛋白胨10 g/L,酵母粉5 g/L,NaCl 10 g/L,蒸馏水1 L,pH值自然。

    液体产酶培养基:NH4Cl 1 g/L,KH2PO4 1 g/L,MgSO4·7H2O 0.5 g/L,蔗糖10 g/L,加蒸馏水配成1 L,pH 值自然[11]

    以上所有培养基均在1×105 Pa灭菌30 min。

  • 1.3 木质素酶高产菌的初筛

    1.3

    将保藏好的菌株活化后,OD调至同一水平,取10 μL菌液接种于苯胺蓝培养基上进行初筛,置于35 ℃的培养箱静置培养3 d,观察苯胺蓝培养基是否有褪色现象。每组实验设有3组平行实验。

  • 1.4 木质素酶高产菌的复筛

    1.4

    将保藏好的菌株活化后,OD调至同一水平,取3 000 μL菌液接种于液体产酶培养基中进行复筛。发酵温度为35 ℃,摇床转速为160 r/min,培养时间为3 d,每组发酵实验设有3个平行。采用木质素酶测定方法对菌株的酶活力进行测定。

    粗酶液的制备:培养结束后将发酵液移取9 mL于10 mL的离心管中,在8 000 r/min,4 ℃下离心10 min,上清液即为粗酶液。

  • 1.5 木质素酶活力的测定

    1.5

    锰过氧化物酶活力的测定[11]:向反应体系中加入 3.4 mL 200 mmol/L,pH 4.5 的乙酸-乙酸钠缓冲溶液、0.1 mL 1.6 mmol/L 的 MnSO4溶液和 0.4 mL的粗酶液,最后加入 0.1 mL 1.6 mmol/L 的 H2O2溶液启动反应,在 37 ℃下反应 3 min,于 240 nm 测定吸光度的变化值。1 个酶活单位(U)定义为:每分钟氧化 1 μmol Mn2+成为 Mn3+ 的需酶量。每个样品平行操作 3 次,取平均值。

    木质素过氧化物酶活力的测定[12]:向反应体系中加入 1.5 mL 250 mmol/L,pH 为 3的酒石酸-酒石酸钠缓冲液、1 mL 15 mmol/L藜芦醇溶液和 0.4 mL的粗酶液,最后加入0.1 mL 20 mmol/L的 H2O2溶液启动反应,在 30 ℃下反应 2 min,于 310 nm 测定吸光度的变化值。1 个酶活单位(U)定义为:每分钟氧化 1 μmol 藜芦醇成为藜芦醛的需酶量。每个样品平行操作 3 次,取平均值。

    漆酶酶活力的测定[13]:向反应体系中加入 2 mL 200 mmol/L,pH 为5 的乙酸-乙酸钠缓冲溶液、0.5 mL 0.5 mmol/L的 ABTS溶液和 0.5 mL的粗酶液,在 28 ℃下反应10 min,于420 nm测定吸光度的变化值。1 个酶活单位(U)定义为:每分钟将 1 μmol ABTS 转化为 ABTS 自由基的需酶量。每个样品平行操作 3 次,取平均值。

  • 1.6 菌株鉴定

    1.6

    菌株L-520的革兰氏染色鉴定参照《伯杰氏系统细菌细菌学手册》第八版[14]。选择木质素酶活力最高的菌株,用16S rDNA引物进行PCR扩增,然后将PCR产物进行测序与分析(上海华大基因公司)。将所得序列在GenBank数据库中进行BLAST比对,并对菌株进行同源对比分析,选择相似性最高的序列并经分析软件Clustal_X 1.81[15]对比后,通过MEGA 5.1[16]软件采用邻近法绘制相关近源菌株的系统发育树。

  • 1.7 培养基的优化

    1.7
  • 1.7.1 碳源种类对产酶的影响

    1.7.1

    固定初始产酶培养基的其他成分,以1%的葡萄糖、可溶性淀粉、蔗糖、乳糖、微晶纤维素作为碳源,以不加任何碳源为对照。将L-520接种于100 mL不同碳源培养基中,35 ℃,160 r/min培养3 d,测定Lac、LiP以及MnP的酶活力。考察不同碳源对木质素酶活力的影响,实验均设有3个平行。

  • 1.7.2 碳源浓度对产酶的影响

    1.7.2

    以蔗糖作为最适碳源,将碳源浓度调节为4、6、8、10、12、14、16 g/L,考察不同碳源浓度对3种木质素酶活力的影响,测定步骤同1.7.1。

  • 1.7.3 氮源种类对产酶的影响

    1.7.3

    固定以1%蔗糖为碳源的产酶培养基,以0.2%硫酸铵、氯化铵、尿素,蛋白胨最为氮源,以不加任何氮源为对照。将L-520接种于100 mL不同氮源培养基中,35 ℃,160 r/min培养3 d,测定3种木质素酶的酶活力。考察不同氮源对酶活力的影响,实验均设有3个平行。

  • 1.7.4 氮源浓度对产酶的影响

    1.7.4

    以氯化铵作为最适氮源,将氮源浓度调节为0.5、1、1.5、2、2.5、3 g/L,考察不同氮源源浓度对3种酶活力的影响,测定步骤同1.7.3。

  • 1.8 培养条件的优化

    1.8

    在进行最佳培养基的研究之后,为了进一步提高菌株木质素酶活力,对发酵培养条件进一步优化。考察了接种量、装液量、培养基初始pH,并设定梯度变化,确定该菌的最佳产酶条件。

  • 1.8.1 接种量对产木质素酶的影响

    1.8.1

    将培养至对数期的L-520按不同的接种量(1%~6%)接种至100 mL液体产酶培养基中,35 ℃,160 r/min条件下培养3 d。进行摇瓶发酵实验,测定酶活。

  • 1.8.2 装液量对产木质素酶的影响

    1.8.2

    在确定接种量的基础上,将L-520菌株接种于不同装液量(50、100、150、200、250、300 mL)的产酶培养基中,35 ℃,160 r/min条件下培养3 d,测定酶活。

  • 1.8.3 初始pH对产木质素酶的影响

    1.8.3

    在接种量、装液量确定的基础上将L-520接种至不同初始pH值(2、3、4、5、6、7、8、9、10)的产酶培养基中,35 ℃,160 r/min条件下培养3 d,测定酶活。

  • 2 结果分析

    2
  • 2.1 木质素酶高产菌的筛选

    2.1

    对甘肃兴隆山森林土壤来源的10株菌株进行活化后接种至苯胺蓝培养基和产酶培养基中进行筛选。采用脱色圈法并进行木质素酶活力的测定。结果表明10株菌株均能产生不同直径的脱色圈,其中L-520菌株的脱色圈直径最大为2.75 cm(表1),为进一步筛选出较高酶活的菌株,通过1.5的方法对酶液进行木质素酶活力的测定。10株菌株中L-515,L-518,L-520 的Lac酶活较高(图1)。L-514,L-520,L-517的MnP酶活较高,L-511,L-519,L-520 的LiP酶活较高,综合比较,L-520产三种木质素酶活较高且稳定。其中Lac、 LiP、MnP酶活力分别为:1.89 U/L, 7.21 U/L, 8.65 U/L。因此选择用L-520菌株进行后续实验研究。

    表1 不同菌株脱色圈的直径

    Table 1 The decolorization circle of different strains

    菌株编号脱色圈的直径/cm
    L-5111.76±0.01
    L-5121.18±0.03
    L-5131.24±0.07
    L-5141.87±0.01
    L-5152.25±0.06
    L-5161.34±0.03
    L-5171.89±0.02
    L-5182.07±0.01
    L-5191.53±0.01
    L-5202.75±0.06
    表1
                    不同菌株脱色圈的直径
    图1
                            初筛过程中不同菌株的酶活

    图1 初筛过程中不同菌株的酶活

    Fig.1 Enzyme activities of different strains

  • 2.2 菌株鉴定

    2.2

    在PDA固体培养基上,菌株L-520的培养初期菌落呈近似圆形状,菌落边缘呈花瓣状,外边缘较薄,核心较厚,颜色为荧光色,尤其是在黑暗环境下,荧光更为强烈。生长时间迅速,24 h就能长满整个培养基。经过革兰氏染色,菌株L-520在显微镜下呈杆状,柱状,呈暗红色,确认为假单胞孢菌属。进一步确定该菌株,在GenBank中搜索出6株相似序列通过MEGA 5.1绘制系统发育树(图2)。

    图2
                            基于16S rDNA的L-520菌株的系统发育树

    图2 基于16S rDNA的L-520菌株的系统发育树

    Fig.2 Phylogenetic tree of L-520 based on the 16S rDNA sequence

    菌株L-520菌株与荧光假单胞杆菌的相似性为99%,可以确定菌株L-520为荧光假单胞杆菌。菌株L-520的16S rDNA的信息已经上传至NCBI,登录号为MG183671。

  • 2.3 培养基优化

    2.3
  • 2.3.1 碳源种类及浓度的优化

    2.3.1

    考察了不同碳源(蔗糖、葡萄糖、乳糖、可溶性淀粉、微晶纤维素,以不添加任何碳源作为对照)对L-520菌株对产木质素酶活的影响。蔗糖为碳源时,木质素的三种酶活力最高,葡萄糖次之(图3, A)。不添加碳源时,不产生漆酶酶活,其他两种酶活均低于添加碳源的酶活,可见,碳源对木质素酶活的产生起重要作用。在此基础上,进一步考察了蔗糖浓度对产木质素酶活的影响。结果表明:随着蔗糖浓度的增加,木质素酶活力呈现先增加后减小的趋势,当蔗糖浓度为10 g/L时,酶活力达到最高,漆酶酶活力超过8.89 U/L,木质素过氧化物大于35.32 U/L,锰过氧化物酶大于85.43 U/L,高于初始培养基的酶活。随着蔗糖浓度的增加酶活力相应的减小(图3, B)。

    图3
                            碳源种类及蔗糖浓度对酶活力的影响

    图3 碳源种类及蔗糖浓度对酶活力的影响

    Fig.3 Effect of carbon source and the concentration of sucrose on the enzyme activities

  • 2.3.2 氮源种类及浓度的优化

    2.3.2

    在1%的蔗糖浓度的基础上,进一步优化氮源,考察不同氮源(硫酸铵、氯化铵、尿素、蛋白胨、不添加氮源为对照)对木质素产酶的影响。当氯化铵(NH4Cl)作为氮源时,3种酶活整体高于其他4种氮源,当蛋白胨作为氮源时只有MnP的酶活较高,而Lac与Lip均较低。当在培养基中不添加任何氮源时,只有Lip的酶活较高,而Lac几乎不产生(图4 ,A)。在此基础上进一步考察了氮源浓度对木质素酶活的影响(图4,B)。

    图4
                            氮源种类及NH4Cl浓度对酶活力的影响

    图4 氮源种类及NH4Cl浓度对酶活力的影响

    Fig.4 Effect of nitrogen source and the concentration of NH4Cl on the enzyme activities

    结果表明,随着氮源浓度的增加,3种酶活均呈现先增加后减小的趋势,当NH4Cl浓度为0.2%时,3种酶活同时达到最高且高于初始值。

  • 2.4 培养条件的优化

    2.4

    分别考察碳源,装液量,接种量,pH四个因素对木质素酶活力的影响,利用单因素实验确定以上四个因素的最优范围,以单因素设计4因素3水平的正交实验考察上述因素对漆酶酶活力的影响。

  • 2.4.1 接种量对木质素酶活力的影响

    2.4.1

    对L-520菌株不同接种量发酵酶液进行酶活力测定,木质素酶活随着接种量的增加呈现先增加后减小的趋势。当接种量为3%时产酶效果最好,当接种量小于3%时,不利于菌株快速增殖,从而影响产酶效果。当接种量大于3%时,在有限空间内,菌株会因为缺氧而衰亡,也会因为初期密度过大,导致所产次级代谢物过多而衰老抑制了木质素酶活的活性(图5)。因此,本研究选择3%的接种量进行后续发酵实验。

    图5
                            接种量对酶活力的影响

    图5 接种量对酶活力的影响

    Fig.5 Effect of inoculum size on the enzyme activities

  • 2.4.2 装液量对木质素酶活力的影响

    2.4.2

    对L-520菌株接种于不同装液量的发酵酶液进行酶活力测定,在50~300 mL范围内木质素酶活力先增加后缓慢减小(图6)。当装液量为100 mL时,三种酶活力达到最高。50、100、150 mL的装液量其实影响不大,但200、250、300 mL的装液量对酶活力影响较大。因为过多的装液量不利于菌株的快速增殖而抑制了菌株的生长,从而抑制了酶活。

    图 6
                            装液量对酶活力的影响

    图 6 装液量对酶活力的影响

    Fig.6 Effect of liquid volume on the enzyme activities

  • 2.4.3 初始pH对木质素酶活力的影响

    2.4.3

    木质素酶的合成和表达受培养基初始pH的影响显著,因此培养基的初始pH直接影响L-520的生长和产酶的代谢活动。在不同的初始pH(pH 2~10)条件下进行发酵培养,以确定木质素酶活力发酵的最适pH值(图7)。结果表明,在偏酸性与偏碱性的环境下,3种木质素酶活力均较低,在pH为4时,MnP的酶活力达到最高值95.89 U/L,在中性及碱性环境下酶活急剧降低。在pH为5时,LiP的酶活力达到最高值106.32 U/L,在中性范围内均有较高的LiP。在pH为6时,Lac酶活达到最高值16.43 U/L且在中性范围内有较高值。

    图7
                            培养基初始 pH对酶活力的影响

    图7 培养基初始 pH对酶活力的影响

    Fig.7 Effect of initial medium pH on the enzyme activities

  • 2.4.4 漆酶正交实验结果

    2.4.4

    表2可以看出,在影响Lac酶活性的因素中,培养液pH对酶活性影响最大。其次是接种量和装液量,最优组合为A2B2C3D1,即pH值为6,碳源浓度为15 g/L,接种量为3 mL,装液量为50 mL时,结果最优。

    表2 漆酶正交实验结果表

    Table 2 Laccase orthogonal test results

    试验号因素Lac(U/L)
    A(pH)B(碳源浓度)C(接种量)D(装液量)
    111118.93
    212229.12
    3133310.54
    4212311.21
    5223116.73
    6231211.37
    7313210.21
    8321311.52
    9332114.41
    K19.5310.1210.1313.36
    K213.1012.4610.6110.23
    K312.0512.1112.4911.09
    R3.572.342.363.13
    表2
                    漆酶正交实验结果表
  • 3 结 论

    3

    本研究通过筛选获得一株高产木质素酶的菌株,通过16S rDNA鉴定为荧光假单胞杆菌。对影响产木质素酶的发酵培养基与发酵条件进行了优化,研究表明,蔗糖与NH4Cl分别作为碳源氮源时产木质素酶活力最高,其中pH对木质素酶活力的影响最大,漆酶在pH为6时,酶活力最高为16.43 U/L,锰过氧化物酶在pH为4时酶活达到95.89 U/L,而木质素过氧化物酶则在pH为5时,酶活达到106.32 U/L。与初始酶活相比分别提高了8.7、11.09、14.74倍。同时对漆酶产酶条件进行了4因素3水平的正交优化,得到最佳组合为A2B2C3D1。杨盛洁[17]所筛选的一株假单胞属菌株的酶活力经过优化之后3种酶活为LiP:34.919 U/L, Lac:7.00 U/L, MnP:31.406 U/L。Salvachúa[18]等人报道的菌株木质素过氧化物酶活为6.03 U/L。本实验菌株与其他研究者的菌株产漆酶活力相当,而木质素过氧化物酶与锰过氧化物酶的活力远高于同类菌株。培养基初始pH对木质素的酶活力影响作用最大,初始pH过大或者过小都会抑制木质素酶活的产生。

    本研究获得了一株高产木质素酶的荧光假单胞杆菌,同时也获得了高产木质素酶的最佳发酵培养基与发酵条件,为该菌株在偶氮染料污水降解方面的应用性研究奠定了基础。

    • 1

      Li W Y, Liu S R, Zhang M Y, et al. Research and development of printing and dyeing wastewater treatment technology [J]. Chengdu Textile Institute, 2016, 33 (4): 142-146.

      李文燕, 刘姝瑞, 张明宇, 等. 印染废水处理技术的研究进展[J].成都纺织高等专科学校学报, 2016, 33(4): 142-146.

    • 2

      Li H R.White rot fungi biology and biotechnology [M]. Beijing: Chemical Industry Press, 2005: 26-52.

      李慧蓉.白腐真菌生物学和生物技术[M].北京:化学工业出版社,2005: 26-52.

    • 3

      Kapdan I, Kargi F, Mcmullan G, et al. Comparison of white rot fungi cultures for decolorization of textile dyestuffs [J]. Bioprocess Eng, 2000, 22(1): 347-351.

    • 4

      Esther F, Tilor C, Gyula O. Removal of synthetic dyes from wastewaters: a review [J]. Enviroument International, 2004, 30(7): 953-971.

    • 5

      Li C, Wei X D, Wang C L, et al. White rot on the simple mixed dye decolorization [J]. Journal of Northeast Forestry University, 2009, 37(6): 73-76.

      李超,魏兴东,汪春蕾,等.白腐菌对简单混合染料的脱色[J].东北林业大学学报, 2009,37(6): 73-76.

    • 6

      Kapdan I, Kargi F, Mcmullan G, et al. Comparison of white rot fungi cultures for decolorization of textile dyestuffs[J]. Bioprocess Eng, 2000, 22(12): 347-351.

    • 7

      Wong Y, Yu J. Laccase-catalyzed decolorization of synthetic dyes [J]. Water Res, 1999, 33(16): 3512-3520.

    • 8

      Osma F J, Toca-Herrea J L, Rodriguez-Couto S. Transformation pathway of Remazol Briliant Blue R by immobilised laccase [J]. Bioresource Technol, 2010, 101(22): 8509-8514.

    • 9

      Li P.Phanerochaete sp. HSD manganese-dependent peroxidase enzyme preparation and mycelial microspheres strengthening treatment of dye wastewater[D]. Xinxiang: Henan Normal University, 2011.

      李平. Phanerochaete sp. HSD的锰依赖性过氧化物酶产酶优化及微菌丝球强化处理染料废水[D]. 新乡:河南师范大学,2011.

    • 10

      Huang Y, Gong M F. Screening and study of lignin-degrading bacteria [J]. Guangdong Chemical Industry, 2016, 43 (8): 56-58 .

      黄艳, 龚明福. 木质素高效降解菌的筛选及研究[J]. 广东化工, 2016, 43(8): 56-58.

    • 11

      Guo W.Establishment of self-immobilized cell system of lignin-degrading fungi mycelium ball[D]. Harbin: Harbin Institute of Technology, 2017.

      国巍. 木质素降解真菌菌丝球自固定化细胞体系的建立[D]. 哈尔冰:哈尔冰工业大学,2017.

    • 12

      Chen H Y. Construction and application of double-bacteria immobilization system composed of marine microorganisms with high yield of lignocellulose[D]. Hangzhou: Zhejiang University, 2014.

      陈慧英. 由高产木质纤维素酶的海洋微生物组成的双菌固定化体系的构建及应用[D]. 杭州:浙江大学,2014.

    • 13

      Jin C X, Yu N. Laccase production optimization by response surface methodology with Aspergillus fumigatus AF1 in unique inexpensive medium and decolorization of different dyes with the crude enzyme or fungal pellets [J]. J Hazard Mater, 2013, 262(1): 512-517.

    • 14

      Buchan R E, N.E. Gibbons, et al.Bergey’s manual of determinative bacteriology (eighth edition)[M]. Beijing:Science press, 1984.

      R.E. 布坎南, N.E. 吉本斯, 等.伯杰细菌鉴定手册(第八版)[M]. 北京:科学出版社, 1984.

    • 15

      Hompson J D, Gibson T J, Plewniak F, et al. The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies formultiple sequence alignment aided by qualisis tools [J]. Nucleic Acids Res, 1997, 25(8): 4876-4882.

    • 16

      Tamura K, Peterson D, Peterson N, et al. MEGA5 molecular evolutionary genetics analysis using maximun linkelihood evolutionary distance, and maximun parsimony methods [J]. Mol Biol Evol , 2011, 28(10): 2731-2739.

    • 17

      Yang S J. Screening of biodegradable straw lignin bacteria[D]. Yangling: Northwest University of Agriculture and Forestry, 2016.

      杨盛洁. 可降解秸秆木质素细菌的筛选[D]. 杨凌:西北农林科技大学, 2016.

    • 18

      Salvachúa D, Karp E M, Nimlos C T, et al. Towards lignin consolidated bioprocessing simultaneous lignin depolymerization and product generation by bacteria [J]. Green Chemistry, 2015, 17(11): 4951-4967.

石晓玲

工作单位:1兰州交通大学 化学与生物工程学院,甘肃 兰州 730070

林胜红

工作单位:1兰州交通大学 化学与生物工程学院,甘肃 兰州 730070

刘震飞

工作单位:1兰州交通大学 化学与生物工程学院,甘肃 兰州 730070

潘晓梅

工作单位:1兰州交通大学 化学与生物工程学院,甘肃 兰州 730070

ALI Ihsan

工作单位:1兰州交通大学 化学与生物工程学院,甘肃 兰州 730070

田永强

工作单位:1兰州交通大学 化学与生物工程学院,甘肃 兰州 730070

联系方式:E-mail: 357181873@qq.com

菌株编号脱色圈的直径/cm
L-5111.76±0.01
L-5121.18±0.03
L-5131.24±0.07
L-5141.87±0.01
L-5152.25±0.06
L-5161.34±0.03
L-5171.89±0.02
L-5182.07±0.01
L-5191.53±0.01
L-5202.75±0.06
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试验号因素Lac(U/L)
A(pH)B(碳源浓度)C(接种量)D(装液量)
111118.93
212229.12
3133310.54
4212311.21
5223116.73
6231211.37
7313210.21
8321311.52
9332114.41
K19.5310.1210.1313.36
K213.1012.4610.6110.23
K312.0512.1112.4911.09
R3.572.342.363.13

表1 不同菌株脱色圈的直径

Table 1 The decolorization circle of different strains

图1 初筛过程中不同菌株的酶活

Fig.1 Enzyme activities of different strains

图2 基于16S rDNA的L-520菌株的系统发育树

Fig.2 Phylogenetic tree of L-520 based on the 16S rDNA sequence

图3 碳源种类及蔗糖浓度对酶活力的影响

Fig.3 Effect of carbon source and the concentration of sucrose on the enzyme activities

图4 氮源种类及NH4Cl浓度对酶活力的影响

Fig.4 Effect of nitrogen source and the concentration of NH4Cl on the enzyme activities

图5 接种量对酶活力的影响

Fig.5 Effect of inoculum size on the enzyme activities

图 6 装液量对酶活力的影响

Fig.6 Effect of liquid volume on the enzyme activities

图7 培养基初始 pH对酶活力的影响

Fig.7 Effect of initial medium pH on the enzyme activities

表2 漆酶正交实验结果表

Table 2 Laccase orthogonal test results

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    • 1

      Li W Y, Liu S R, Zhang M Y, et al. Research and development of printing and dyeing wastewater treatment technology [J]. Chengdu Textile Institute, 2016, 33 (4): 142-146.

      李文燕, 刘姝瑞, 张明宇, 等. 印染废水处理技术的研究进展[J].成都纺织高等专科学校学报, 2016, 33(4): 142-146.

    • 2

      Li H R.White rot fungi biology and biotechnology [M]. Beijing: Chemical Industry Press, 2005: 26-52.

      李慧蓉.白腐真菌生物学和生物技术[M].北京:化学工业出版社,2005: 26-52.

    • 3

      Kapdan I, Kargi F, Mcmullan G, et al. Comparison of white rot fungi cultures for decolorization of textile dyestuffs [J]. Bioprocess Eng, 2000, 22(1): 347-351.

    • 4

      Esther F, Tilor C, Gyula O. Removal of synthetic dyes from wastewaters: a review [J]. Enviroument International, 2004, 30(7): 953-971.

    • 5

      Li C, Wei X D, Wang C L, et al. White rot on the simple mixed dye decolorization [J]. Journal of Northeast Forestry University, 2009, 37(6): 73-76.

      李超,魏兴东,汪春蕾,等.白腐菌对简单混合染料的脱色[J].东北林业大学学报, 2009,37(6): 73-76.

    • 6

      Kapdan I, Kargi F, Mcmullan G, et al. Comparison of white rot fungi cultures for decolorization of textile dyestuffs[J]. Bioprocess Eng, 2000, 22(12): 347-351.

    • 7

      Wong Y, Yu J. Laccase-catalyzed decolorization of synthetic dyes [J]. Water Res, 1999, 33(16): 3512-3520.

    • 8

      Osma F J, Toca-Herrea J L, Rodriguez-Couto S. Transformation pathway of Remazol Briliant Blue R by immobilised laccase [J]. Bioresource Technol, 2010, 101(22): 8509-8514.

    • 9

      Li P.Phanerochaete sp. HSD manganese-dependent peroxidase enzyme preparation and mycelial microspheres strengthening treatment of dye wastewater[D]. Xinxiang: Henan Normal University, 2011.

      李平. Phanerochaete sp. HSD的锰依赖性过氧化物酶产酶优化及微菌丝球强化处理染料废水[D]. 新乡:河南师范大学,2011.

    • 10

      Huang Y, Gong M F. Screening and study of lignin-degrading bacteria [J]. Guangdong Chemical Industry, 2016, 43 (8): 56-58 .

      黄艳, 龚明福. 木质素高效降解菌的筛选及研究[J]. 广东化工, 2016, 43(8): 56-58.

    • 11

      Guo W.Establishment of self-immobilized cell system of lignin-degrading fungi mycelium ball[D]. Harbin: Harbin Institute of Technology, 2017.

      国巍. 木质素降解真菌菌丝球自固定化细胞体系的建立[D]. 哈尔冰:哈尔冰工业大学,2017.

    • 12

      Chen H Y. Construction and application of double-bacteria immobilization system composed of marine microorganisms with high yield of lignocellulose[D]. Hangzhou: Zhejiang University, 2014.

      陈慧英. 由高产木质纤维素酶的海洋微生物组成的双菌固定化体系的构建及应用[D]. 杭州:浙江大学,2014.

    • 13

      Jin C X, Yu N. Laccase production optimization by response surface methodology with Aspergillus fumigatus AF1 in unique inexpensive medium and decolorization of different dyes with the crude enzyme or fungal pellets [J]. J Hazard Mater, 2013, 262(1): 512-517.

    • 14

      Buchan R E, N.E. Gibbons, et al.Bergey’s manual of determinative bacteriology (eighth edition)[M]. Beijing:Science press, 1984.

      R.E. 布坎南, N.E. 吉本斯, 等.伯杰细菌鉴定手册(第八版)[M]. 北京:科学出版社, 1984.

    • 15

      Hompson J D, Gibson T J, Plewniak F, et al. The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies formultiple sequence alignment aided by qualisis tools [J]. Nucleic Acids Res, 1997, 25(8): 4876-4882.

    • 16

      Tamura K, Peterson D, Peterson N, et al. MEGA5 molecular evolutionary genetics analysis using maximun linkelihood evolutionary distance, and maximun parsimony methods [J]. Mol Biol Evol , 2011, 28(10): 2731-2739.

    • 17

      Yang S J. Screening of biodegradable straw lignin bacteria[D]. Yangling: Northwest University of Agriculture and Forestry, 2016.

      杨盛洁. 可降解秸秆木质素细菌的筛选[D]. 杨凌:西北农林科技大学, 2016.

    • 18

      Salvachúa D, Karp E M, Nimlos C T, et al. Towards lignin consolidated bioprocessing simultaneous lignin depolymerization and product generation by bacteria [J]. Green Chemistry, 2015, 17(11): 4951-4967.