引用本文 ↓

张芙蓉.HZ201树脂在新型酶法制备D-茶氨酸中的应用[J].生物资源, 2018, 40(4): 361-365.

Zhang F R. Application of HZ201 resin in enzymatic preparation of N-carbamoyl-D-theanine [J]. Biotic Resources, 2018, 40(4): 361-365.

    摘要

    以新型物质D-茶氨酸的酶法制备过程为研究对象,考察了HZ201(Cl-)强碱型阴离子树脂在不同温度下吸附情况及动态实验的洗脱流速,研究结果表明:在25 ℃时,以8 mL/min稀HCl洗脱,分离出D,L-N-乙基海因丙酰胺酶转化产物,经结构鉴定为N-氨甲酰-D-茶氨酸,该新物质收率达71%,为D-茶氨酸的生物法制备提供了新途径。

    Abstract

    For enzymatic preparation of the new substance D-theanine, adsorption conditions at different temperatures and elution flow rate of the basic resin HZ201 were studied. The result showed that enzymatic transformation product from N-ethyl-3-(2,5-dioxoimidazolidin-4-yl) propanamide was separated by gradient elution of flow rate 8 mL/min with dilute hydrochloric acid at 25 ℃, which was identified as N-carbamoyl-D-theanine with the yield of 71%, providing a new way for the biological preparation of D-theanine.

  • 0 引 言

    0

    离子交换是一种应用广泛的色谱技术,用来分离性质相近的离子,长期用于食品、水处理的提取、精制和回收。离子交换吸附的原理是离子交换树脂可以对待分离液体进行选择性吸附。在工业化生产应用上,离子交换树脂具有选择性高、交换容量大、操作不繁琐、便于工业自动化控制、设备不复杂、具有再生能力、可重复使用等显著优势[1,2,3,4,5],在多种有机酸、氨基酸等的分离中也有着非常广泛的应用[6,7,8]

    茶氨酸具有降血压[9]、抑制肿瘤细胞生长[10]、松弛神经紧张、放松等作用[11],对脑神经细胞有保护作用[12]。茶氨酸是光学纯物质,对于L-茶氨酸的合成方法已经有大量研究与报道[13,14,15],但是对于D-茶氨酸的研究报道很少。本实验室已经研究出海因酶制备D-茶氨酸的方法,同时在实验中发现,D,L-N-乙基海因丙酰胺和新物质N-氨甲酰-D-茶氨酸混合液的最佳吸附树脂是HZ201,在25 ℃,pH为3时,反应时间为20 min, 可实现新物质N-氨甲酰-D-茶氨酸吸附率高达90%以上(未发表)。本实验将HZ201树脂应用于酶法制备D-茶氨酸,最终分离出纯度较高的新型物质N-氨甲酰-D-茶氨酸,通过酸消解作用得到D-茶氨酸,从而提供了一条生物法制备D-茶氨酸的途径。

  • 1 材料与方法

    1
  • 1. 1 材料和仪器

    1. 1

    碱性或酸性树脂(AR,湖北新四海化工股份有限公司),HCl(AR,上海国药集团有限公司),NaOH(AR,上海国药集团有限公司),N-氨甲酰-D-茶氨酸、D,L-N-乙基海因丙酰胺由实验室制备。

    DBS-100自动部分收集器(浙江赛德仪器有限公司),THZ-C-1台式冷冻恒温振荡器(上海一恒科学仪器有限公司),PHS-3C型精密pH计(上海一恒科学仪器有限公司),电子天平(上海天美天平仪器有限公司)。

    1. 2 分析方法

    1. 2. 1 色谱条件

    色谱柱:SinoChrom ODS-BP(C18,5 μm,6.0 mm×150 mm);流动相:甲醇-磷酸二氢钾(20 mmol/L),体积比50 mL∶50 mL;流速:1 mL/min;检测波长:220 nm;进样量:20 μL;室温:20 ℃。

  • 1. 2 . 2 标准曲线的制作

    1. 2

    分别精确制备浓度范围为0.04~0.28 mg/mL的D,L-N-乙基海因丙酰胺溶液和0.2~2 mg/mL的N-氨甲酰-D-茶氨酸溶液,通过HPLC分别测出峰面积,并绘制D,L-N-乙基海因丙酰胺和N-氨甲酰-D-茶氨酸的标准曲线。

    1. 3 实验方法

    1. 3. 1 海因酶转化制备N-氨甲酰-D-茶氨酸

    取海因酶纯酶液加入D,L-N-乙基海因丙酰胺(溶于pH 9.0, 0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液)底物溶液中,在37 ℃、180 r/min条件下转化24 h后,分时间段记录转化液pH值变化,同时分时间段测定转化液中N-氨甲酰-D-茶氨酸的浓度,转化液在4 ℃条件下保藏。

  • 1. 3 . 2 树脂吸附等温效果

    1. 3

    精确称取经过预处理且除去表面水的HZ201树脂8份,每份1.000 g,置于100 mL锥形瓶中,之后加入浓度分别为0.03,0.10,0.20,0.40,0.50,0.60,0.90,1.20 mg/mL的N-氨甲酰-D-茶氨酸溶液20 mL,调节pH为3,分别在25、35、45 ℃条件下,170 r/min,恒温振荡4 h至平衡。上清液中N-氨甲酰-D-茶氨酸浓度使用高效液相色谱测量,依据公以下式计算平衡吸附量:

    Qe (mg/g): Qe=(C0Ce)V/W (1)

    其中,Qe 为平衡吸附量(mg/g),C0为吸附体系中所加N-氨甲酰-D-茶氨酸溶液的初始质量浓度(mg/mL),Ce为吸附体系中吸附平衡后上清液中N-氨甲酰-D-茶氨酸质量浓度(mg/mL),V为吸附体系中所加N-氨甲酰-D-茶氨酸溶液体积(mL),W为吸附体系中所加树脂的质量(g)。

  • 1. 3 . 3 动态实验

    1. 3

    使用的层析柱柱长100 cm,内径1.1 cm。取已用水浸泡预处理过的HZ201湿法填柱,精确量取80 mL。实验室制备的N-氨甲酰-D-茶氨酸以不同的流量通过柱子,分部收集器固定时间段收集流出液,测定每份收集液中的N-氨甲酰-D-茶氨酸的浓度,绘制出穿透曲线图,确定最佳流量。

    在最佳流量下,用转化液上柱,分离D,L-N-乙基海因丙酰胺和N-氨甲酰-D-茶氨酸两物质以提取N-氨甲酰-D-茶氨酸。N-氨甲酰-D-茶氨酸的动态吸附量Q按下式计算:

    Q=(C0V0−∑CiVi)/W (2)

    其中,Q为吸附柱的动态吸附量(mg/g),C0是起始质量浓度,V0为动态吸附的上柱液体积(mL),Vi为动态吸附第i收集液的体积(mL),Ci为动态吸附第i收集液的浓度(g/L),W为吸附柱中干树脂的质量(g)。

  • 1. 3 . 4 动态分离海因酶转化液

    1. 3

    为了提高HZ201树脂的分离效率和可操作性,对HZ201树脂在25 ℃时的动态吸附进行了研究。 取20 mL海因酶转化液,2 000 r/min离心,调节pH为3,上柱,得到酶液中含有的N-氨甲酰-D-茶氨酸的纯品,进行物质结构鉴定、测定旋光度和纯度。

  • 2 结果与讨论

    2
  • 2. 1 标准曲线

    2. 1

    按照1.2.2 所示方法,以标准液浓度为横坐标,得出D,L-N-乙基海因丙酰胺和N-氨甲酰-D-茶氨酸的标准曲线公式如下:

    N-氨甲酰-D-茶氨酸的标准曲线公式为:Y=0.6X+3×106,(X为浓度mg/mL,0.2≤X≤2,R2=0.999 4)

    D,L-N-乙基海因丙酰胺的标准曲线公式为:Y=0.7X+2×106,(X为浓度mg/mL,0.04≤X≤0.28,R2=0.999 1)

  • 2. 2 树脂吸附等温效果

    2. 2

    图1可见,随着N-氨甲酰-茶氨酸的浓度的增加,HZ201树脂对它的平衡吸附量也慢慢增加,随着温度的逐渐升高,吸附量慢慢下降,因此该吸附反应为放热反应。其中,Ce为达到吸附平衡时液相主体的浓度;Qe为达到吸附平衡时单位重量吸附剂的吸附量;Qm为单位重量吸附剂表面形成单分子层排列的最大量;Kd为吸附平衡的解离常数;k为吸附量的相对大小,而指数n为吸附剂表面的不均匀性和吸附强度的相对大小。回归方程常数及相关系数R汇总于表1

    图1
                            HZ201树脂在不同温度下对N-氨甲酰-茶氨酸的吸附影响

    图1 HZ201树脂在不同温度下对N-氨甲酰-茶氨酸的吸附影响

    Fig. 1 Adsorption effect of HZ201 on N-ammonia-theanine at different temperatures

    表1 Freundlich和Langmuri方程对N-氨甲酰-D-茶氨酸在HZ201上不同温度下的吸附等温线拟合结果

    Table 1 Freundlich and Langmuri equations are matched by the adsorption isotherm of N-ammonia-D-theanine at different temperatures on HZ201

    树脂温度/℃吸附等温拟合方程knQm/mg.g-1

    Kd

    /L.mg-1

    R2
    HZ20125In Qe =0.354InCe+2.77716.9402.4360.991
    35In Qe =0.373InCe+2.66614.3852.6810.985
    45In Qe =0.336InCe+2.50712.2103.0840.975

    25

    35

    45

    Ce/Qe=0.010 3Ce+0.053 2

    Ce/Qe=0.012 4Ce+0.058 7

    Ce/Qe=0.012 6Ce+0.071 5

    97.087

    80.645

    79.365

    0.194

    0.212

    0.176

    0.976

    0.969

    0.979

    表1
                    Freundlich和Langmuri方程对N-氨甲酰-D-茶氨酸在HZ201上不同温度下的吸附等温线拟合结果

    据此采用Freundlich和Langmuir吸附经验方程[16,17]对上述实验数据进行拟合:

    Freundlich方程: InQe = nInCe + InK (3)

    Langmuir 方程: Ce/Qe = Ce/Qm + Kd/Qm (4)

    表1我们可以分析得出,拟合方程与真实测定数据的相关系数R2都非常高,并且在25 ℃时,Freundlich方程拟合的R2高达0.991,因此Freundlich方程在25 ℃时相较于Langmuir 方程,可以更加准确地描述HZ201树脂对N-氨甲酰-茶氨酸的吸附状态。在Freundlich方程中,当n在2~10范围时,该吸附行为易于产生,称之为优惠吸附[18,19];当n在1~2范围时,不易吸附;而当n<1时,吸附很难发生。上表中n>1,为优惠吸附。同时k随着温度的上升而逐渐变小,不难得出结论,低温有利于HZ201树脂的对N-氨甲酰-茶氨酸的吸附。

    2. 3 动态实验

    2. 3. 1 最佳洗脱流速

    一般情况下,穿透曲线主要受N-氨甲酰-D-茶氨酸的浓度、洗脱液体积、氢键作用力、表面基团的类型等影响。当吸附和穿透点一致时,树脂吸附慢慢减少,分离液体开始流出,因此,通过穿透曲线实验,可以确定适合的流速和洗脱液的体积,反映树脂的分离效率。由图2看出,在流速为8 mL/min时,穿透点较为靠前并且在短时间内快速达到平衡,吸附量较多。因此,选择8 mL/min作为动态实验的最佳流速。

    图2
                            在不同流速下N-氨甲酰-茶氨酸在HZ201树脂柱的穿透曲线

    图2 在不同流速下N-氨甲酰-茶氨酸在HZ201树脂柱的穿透曲线

    Fig. 2 Penetration curve of N-ammonia-theanine on the HZ201 resin column at different velocities

  • 2. 3 . 2 穿透洗脱曲线

    2. 3

    图3可知,在25 ℃时,D,L-N-乙基海因丙酰胺和N-氨甲酰-茶氨酸混合液20 mL上样后,先用去离子水洗脱,没有物质被检测到,当洗脱100 mL后,检测到有D,L-N-乙基海因丙酰胺,当洗脱250 mL时,N-氨甲酰-茶氨酸和D,L-N-乙基海因丙酰胺都被检测到,当洗脱298 mL时,只有N-氨甲酰-茶氨酸被检测到,于是用1 mol/L的HCl快速洗脱,仅用了100 mL的HCl溶液,N-氨甲酰-茶氨酸被完全洗脱下来。

    图3
                            25 ℃时N-氨甲酰-茶氨酸和D,L-N-乙基海因丙酰胺液穿透与洗脱曲线

    图3 25 ℃时N-氨甲酰-茶氨酸和D,L-N-乙基海因丙酰胺液穿透与洗脱曲线

    Fig. 3 Penetration and elution curves of N-carbamyl-theanine and D,L-N-ethyl maine propionamide at 25 ℃

    由此可分析,D,L-N-乙基海因丙酰胺呈电中性,它与HZ201树脂主要是通过范德华力结合,结合力较弱,由于D,L-N-乙基海因丙酰胺极性较大,根据吸附过程中的“相似相吸”的原理,较易被去离子水洗脱;而N-氨甲酰-茶氨酸与HZ201树脂主要是通过静电力结合,结合力远大于分子间的范德华力。同时,N-氨甲酰-茶氨酸极性较弱,较难溶于水。因此,可以利用盐酸溶液将D,L-N-乙基海因丙酰胺和N-氨甲酰-茶氨酸先后分别从HZ201树脂上洗脱下来。

  • 2. 4 N-氨甲酰-D-茶氨酸NMR表征、旋光度及高分辨质谱

    2. 4

    在实验室条件下,建立了纯化工艺,使用海因酶转化D,L-N-乙基海因丙酰胺,混合液通过柱子,运用上述一样的方法和条件顺利得到了转化液中的N-氨甲酰-D-茶氨酸,分离度高达80%。采用氢谱、碳谱、质谱等进行结构表征,具体数据如下。

    白色晶体,产率71%,m.p.162~167 ℃,[α]D25-12.4(c 0.50,H2O);1H NMR (D2O,500 MHz) δ:4.16-4.19 (q,J=4.7 Hz,1H),3.16-3.20 (q,J=7.3 Hz,2H),2.32-2.35 (t,J=7.3 Hz,2H),2.13-2.20(m,2H),1.91-1.99 (m,2H),1.03-1.10(t,J=7.3 Hz,3H); 13C NMR (DMSO,300 MHz) δ:174.37,170.89,158.28,51.97,33.26,31.62,28.17,14.67。

    通过高分辨质谱可以确定其分子量为217,经分析,证明产物为N-氨甲酰-D-茶氨酸。

  • 3 结 论

    3

    本文利用离子交换的方法对终产物和中间产物进行分离,并借助真空浓缩、固液分离辅助提取手段,为D-茶氨酸的生物制备提供了新途径。同时确定了在酶转化体系中,25 ℃时最佳纯化条件为:HZ201(Cl-)强碱凝胶型阴离子树脂,pH 3,HCl洗脱浓度0.01 mol/L,分离出新物质N-氨甲酰-D-茶氨酸,通过酸消解作用获得高纯度D-茶氨酸,收率71%。

    • 1

      Dethe M J, Marathe K V, Gaikar V G. Adsorption of lactic acid on weak base polymeric resins [J]. Sep Sci Technol, 2006, 41(13): 2947-2971.

    • 2

      Cao X J, Yun H S, Koo Y M. Recovery of L-(+)-lactic acid by anion exchange resin Amberlite IRA-400 [J]. Biochem Eng J, 2002, 11(2): 189-196.

    • 3

      Xu C, Long C, Li A M, et al. Adsorption characteristics of fumaric acid onto weakly basic hypercross linked polystyrene ion-exchangers [J]. Adsorpt Sci Technol, 2006, 24(1): 65-77.

    • 4

      Gu J F. The application of ion exchange and adsorption resin in pharmaceutical industry[M]. Beijing: China Medical Science and Technology Press, 2008: 23.

      顾觉奋. 离子交换与吸附树脂在制药工业上的应用[M]. 北京: 中国医药科技出版社, 2008: 23.

    • 5

      Fan R G, Dai Y, Dong X, et al. Study on the adsorption characteristics of strongly basic anion exchange resin for sulfadimidine [J]. Ion Exchange and Adsorption, 2017, 33(1): 46-55.

      范荣桂, 戴艺, 董雪, 等. 强碱性阴离子交换树脂对水中磺胺二甲基嘧啶的吸附特性[J]. 离子交换与吸附, 2017, 33(1): 46-55.

    • 6

      Ding M Y, Chen P R, Luo G A. Simultaneous separation of organic acids, inorganic anions and alkaline earth metal cations using single anion exchange column [J]. Chinese Journal of Analytical Chemistry, 1997, 20(8): 1639-1644.

      丁明玉, 陈培榕, 罗国安. 单一阴离子交换柱同时分离有机酸和无机阴阳离子[J]. 分析化学, 1997, 20(8): 1639-1644.

    • 7

      Wu C L, Guo C J. Separation and purification of amino acids by ion exchange [J]. Amino Acids and Biotic Resources, 2005, 27(4): 50-53

      武彩莲, 郭长江. 离子交换法与氨基酸的分离纯化[J]. 氨基酸和生物资源, 2005, 27(4): 50-53.

    • 8

      Tao Z Y, Zhang B L, Shen F L. Mechanism of uptake of amino acid on ion exchange resin in dilute solutions [J]. Acta Physico-chimica Sinica, 1992, 8(4): 464-469.

      陶祖贻, 张保林, 盛芬玲. 低浓度下离子交换树脂吸附氨基酸的机理[J]. 物理化学学报, 1992, 8(4): 464-469.

    • 9

      Kimura K, Ozeki M, Juneja L R, et al. L-theanine reduces psychological and physiological stress responses [J]. Biological Psychology, 2007, 74(1): 39-45.

    • 10

      Jian L, Ping L, Fang L. Production of theanine by Xerocomus badius (mushroom) using submerged fermentation [J]. LWT, 2008, 41(5): 883-889.

    • 11

      Haskell C F, Kennedy D O, Milne A L, et al. The effects of L-theanine, caffeine and their combination on cognition and mood [J]. Biological Psychology, 2008, 77(2): 113-122.

    • 12

      Hong-Suk C, Seung K, Sook-Young L, et al. Protective effect of the green tea component, L-theanine on environmental toxins-induced neuronal cell death [J]. Neuro Toxicology, 2008, 29(4): 656-662.

    • 13

      Huang Z, Ough C S. Determination of amine acid hydantoine by HPLC with diode array detection [J]. J Agric Food Chem, 1991, 39(12): 2218-2222.

    • 14

      Cao F, Wei P, Zhou J D, et al. A method for preparing optically active theanine by an enzyme method: China, CN101649334 [P]. 2010-02-17.

      曹飞, 韦萍, 周佳栋, 等. 一种酶法制备光学活性茶氨酸的方法: 中国, CN101649334 [P]. 2010-02-17.

    • 15

      Zhang X F, Mo Z H, Wang L L. Mechanism of uptake of amino acid on ion exchange resin in dilute solutions [J]. Acta Physico-Chimica Sinica, 2009, 16(1): 76-79.

      张小飞, 莫章桦, 王璐璐. 产海因酶和水解酶菌的假单胞杆菌的性质研究[J]. 药物生物技术, 2009, 16(1): 76-79.

    • 16

      Cao N J, Du J X, Tsao G T, et al. Simultaneous production and recovery of fumaric acid from immobilized rhizopus oryzae with a rotary biofilm contactor and an adsorption column [J]. Appl Environ Microbiol, 1996, 62(8): 2926-2931.

    • 17

      Davision B H, Nghiem N P, Richardson G L. Succinic acid adsorption from fermentation broth and regeneration [J]. Appl Biochem Biotechnol, 2004, 113-116(1-3): 653-669.

    • 18

      Xi K. Biochemical separation engineering [M]. Beijing: Chemical Industry Press, 2001: 252-258.

      希康. 生化分离工程[M]. 北京: 化学工业出版社, 2001: 252-258.

    • 19

      He B L, Huang W Q. Exchange and adsorption resin[M]. Shanghai: Shanghai Science Education Press, 1995: 174.

      何炳林, 黄文强. 离子交换与吸附树脂[M]. 上海: 上海科学教育出版社, 1995: 174.

张芙蓉

工作单位:1江苏神华药业有限公司,江苏 淮安 211600

/html/swzy/201804010/alternativeImage/b3ef8bf4-d494-4dbb-8071-5696aeaf64bd-F001.jpg
树脂温度/℃吸附等温拟合方程knQm/mg.g-1

Kd

/L.mg-1

R2
HZ20125In Qe =0.354InCe+2.77716.9402.4360.991
35In Qe =0.373InCe+2.66614.3852.6810.985
45In Qe =0.336InCe+2.50712.2103.0840.975

25

35

45

Ce/Qe=0.010 3Ce+0.053 2

Ce/Qe=0.012 4Ce+0.058 7

Ce/Qe=0.012 6Ce+0.071 5

97.087

80.645

79.365

0.194

0.212

0.176

0.976

0.969

0.979

/html/swzy/201804010/alternativeImage/b3ef8bf4-d494-4dbb-8071-5696aeaf64bd-F002.jpg
/html/swzy/201804010/alternativeImage/b3ef8bf4-d494-4dbb-8071-5696aeaf64bd-F003.jpg

图1 HZ201树脂在不同温度下对N-氨甲酰-茶氨酸的吸附影响

Fig. 1 Adsorption effect of HZ201 on N-ammonia-theanine at different temperatures

表1 Freundlich和Langmuri方程对N-氨甲酰-D-茶氨酸在HZ201上不同温度下的吸附等温线拟合结果

Table 1 Freundlich and Langmuri equations are matched by the adsorption isotherm of N-ammonia-D-theanine at different temperatures on HZ201

图2 在不同流速下N-氨甲酰-茶氨酸在HZ201树脂柱的穿透曲线

Fig. 2 Penetration curve of N-ammonia-theanine on the HZ201 resin column at different velocities

图3 25 ℃时N-氨甲酰-茶氨酸和D,L-N-乙基海因丙酰胺液穿透与洗脱曲线

Fig. 3 Penetration and elution curves of N-carbamyl-theanine and D,L-N-ethyl maine propionamide at 25 ℃

image /

无注解

无注解

无注解

无注解

    • 1

      Dethe M J, Marathe K V, Gaikar V G. Adsorption of lactic acid on weak base polymeric resins [J]. Sep Sci Technol, 2006, 41(13): 2947-2971.

    • 2

      Cao X J, Yun H S, Koo Y M. Recovery of L-(+)-lactic acid by anion exchange resin Amberlite IRA-400 [J]. Biochem Eng J, 2002, 11(2): 189-196.

    • 3

      Xu C, Long C, Li A M, et al. Adsorption characteristics of fumaric acid onto weakly basic hypercross linked polystyrene ion-exchangers [J]. Adsorpt Sci Technol, 2006, 24(1): 65-77.

    • 4

      Gu J F. The application of ion exchange and adsorption resin in pharmaceutical industry[M]. Beijing: China Medical Science and Technology Press, 2008: 23.

      顾觉奋. 离子交换与吸附树脂在制药工业上的应用[M]. 北京: 中国医药科技出版社, 2008: 23.

    • 5

      Fan R G, Dai Y, Dong X, et al. Study on the adsorption characteristics of strongly basic anion exchange resin for sulfadimidine [J]. Ion Exchange and Adsorption, 2017, 33(1): 46-55.

      范荣桂, 戴艺, 董雪, 等. 强碱性阴离子交换树脂对水中磺胺二甲基嘧啶的吸附特性[J]. 离子交换与吸附, 2017, 33(1): 46-55.

    • 6

      Ding M Y, Chen P R, Luo G A. Simultaneous separation of organic acids, inorganic anions and alkaline earth metal cations using single anion exchange column [J]. Chinese Journal of Analytical Chemistry, 1997, 20(8): 1639-1644.

      丁明玉, 陈培榕, 罗国安. 单一阴离子交换柱同时分离有机酸和无机阴阳离子[J]. 分析化学, 1997, 20(8): 1639-1644.

    • 7

      Wu C L, Guo C J. Separation and purification of amino acids by ion exchange [J]. Amino Acids and Biotic Resources, 2005, 27(4): 50-53

      武彩莲, 郭长江. 离子交换法与氨基酸的分离纯化[J]. 氨基酸和生物资源, 2005, 27(4): 50-53.

    • 8

      Tao Z Y, Zhang B L, Shen F L. Mechanism of uptake of amino acid on ion exchange resin in dilute solutions [J]. Acta Physico-chimica Sinica, 1992, 8(4): 464-469.

      陶祖贻, 张保林, 盛芬玲. 低浓度下离子交换树脂吸附氨基酸的机理[J]. 物理化学学报, 1992, 8(4): 464-469.

    • 9

      Kimura K, Ozeki M, Juneja L R, et al. L-theanine reduces psychological and physiological stress responses [J]. Biological Psychology, 2007, 74(1): 39-45.

    • 10

      Jian L, Ping L, Fang L. Production of theanine by Xerocomus badius (mushroom) using submerged fermentation [J]. LWT, 2008, 41(5): 883-889.

    • 11

      Haskell C F, Kennedy D O, Milne A L, et al. The effects of L-theanine, caffeine and their combination on cognition and mood [J]. Biological Psychology, 2008, 77(2): 113-122.

    • 12

      Hong-Suk C, Seung K, Sook-Young L, et al. Protective effect of the green tea component, L-theanine on environmental toxins-induced neuronal cell death [J]. Neuro Toxicology, 2008, 29(4): 656-662.

    • 13

      Huang Z, Ough C S. Determination of amine acid hydantoine by HPLC with diode array detection [J]. J Agric Food Chem, 1991, 39(12): 2218-2222.

    • 14

      Cao F, Wei P, Zhou J D, et al. A method for preparing optically active theanine by an enzyme method: China, CN101649334 [P]. 2010-02-17.

      曹飞, 韦萍, 周佳栋, 等. 一种酶法制备光学活性茶氨酸的方法: 中国, CN101649334 [P]. 2010-02-17.

    • 15

      Zhang X F, Mo Z H, Wang L L. Mechanism of uptake of amino acid on ion exchange resin in dilute solutions [J]. Acta Physico-Chimica Sinica, 2009, 16(1): 76-79.

      张小飞, 莫章桦, 王璐璐. 产海因酶和水解酶菌的假单胞杆菌的性质研究[J]. 药物生物技术, 2009, 16(1): 76-79.

    • 16

      Cao N J, Du J X, Tsao G T, et al. Simultaneous production and recovery of fumaric acid from immobilized rhizopus oryzae with a rotary biofilm contactor and an adsorption column [J]. Appl Environ Microbiol, 1996, 62(8): 2926-2931.

    • 17

      Davision B H, Nghiem N P, Richardson G L. Succinic acid adsorption from fermentation broth and regeneration [J]. Appl Biochem Biotechnol, 2004, 113-116(1-3): 653-669.

    • 18

      Xi K. Biochemical separation engineering [M]. Beijing: Chemical Industry Press, 2001: 252-258.

      希康. 生化分离工程[M]. 北京: 化学工业出版社, 2001: 252-258.

    • 19

      He B L, Huang W Q. Exchange and adsorption resin[M]. Shanghai: Shanghai Science Education Press, 1995: 174.

      何炳林, 黄文强. 离子交换与吸附树脂[M]. 上海: 上海科学教育出版社, 1995: 174.